近年来，基因编辑技术的迅猛发展为生命科学研究带来了深刻变革，尤其是CRISPR-Cas13 RNA靶向系统在基础与应用科学中广泛应用，成为科研人员的重要工具。然而，在哺乳动物细胞和小鼠模型中的旁切效应，以及在体内靶向能力的局限性和效率的不稳定性等因素，限制了其在体内应用的广泛性。为此，西班牙安达卢西亚发育生物学中心等研究团队在2025年3月于《Nature Communications》上发表的新研究成果提供了一系列优化的策略工具，针对斑马鱼中的RNA靶向CRISPR-Cas技术进行了显著的提升。

研究亮点

研究中提出了五种互补的斑马鱼RNA靶向CRISPR-Cas技术优化策略，包括化学修饰的gRNA、核定位信号（NLS）组合优化、IVT gRNA毒性筛查、RNA靶向模型预测及替代系统。这些策略通过斑马鱼胚胎模型的评估与优化，解决了基因靶向效率低、部分体外转录gRNA毒性、核RNA靶向困难等一系列问题，从而显著增强了CRISPR-Cas技术在生物医学中的应用潜力。同时，这项研究为基于RNA敲降的生物技术和生物医学治疗应用提供了重要的依据和优化策略。

研究背景

CRISPR-RfxCas13d是一种来源于黄化瘤胃球菌XPD3002的II类/VI型CRISPR-Cas RNA核酸内切酶，借助向导RNA（gRNA）通过RNA-RNA杂交的方式靶向RNA。该系统已显示出在生物技术及医学领域的巨大潜力。然而，研究人员指出了一系列待解决的限制因素以扩展其在体内的应用能力。通过斑马鱼模型的不同方法，研究团队增强了RNA靶向的CRISPR-Cas技术，并优化了瞬时递送制剂，以增强CRISPR-RfxCas13d系统在斑马鱼中的效果。

研究结果

研究显示，经过优化的CRISPR-RfxCas13d向导RNA在斑马鱼胚胎中实现了简单且持续的靶向作用，且通过化学修饰的cm-gRNA显著提高了基因功能缺失表型。此外，研究还发现在斑马鱼胚胎中进行体外转录的gRNA可能引发严重的发育毒性，揭示出毒性源于体外转录合成过程。

替代CRISPR-Cas系统

尽管CRISPR-RfxCas13d在靶向内源性mRNA时展现出较低的附带活性，某些情况下仍可能影响其在体内的应用。因此，研究人员对CRISPR-Cas7-11、CRISPR-DjCas13d和高保真版本的RfxCas13d（Hf-RfxCas13d）等替代系统进行了评估。这些替代系统显示出在靶向超高丰度外源RNA时具有低于或相当于CRISPR-RfxCas13d的靶向效率和低附带活性，展现出良好的应用前景。

总结

本研究通过多种优化策略显著增强了CRISPR-Cas13d在斑马鱼胚胎模型中的瞬时靶向RNA的效率、特异性和安全性。尤其是在靶向内源mRNA时，其副作用极小且无生理影响，这为后续的生物技术和医疗研究提供了重要的参考。此外，研究团队还建议使用CRISPR-Cas7-11和DJ-Cas13d作为低附带活性替代方案，以期在更广泛的应用领域中实现有效的基因编辑。

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